PCR con transcriptase inversa

A reacción en cadea da polimerase con transcriptase inversa (ou PCR tras transcriptase inversa), abreviada como RT-PCR (do inglés reverse transcriptase PCR) é unha das moitas variantes da reacción en cadea da polimerase (PCR) na que previamente se realiza unha reversotranscrición. Esta técnica úsase comunmente en bioloxía molecular para detectar a expresión do ARN.^[1] A PCR con transcriptase inversa (RT-PCR) confúndese a miúdo coa PCR en tempo real ou cuantitativa (qPCR), que ás veces tamén se ve abreviada como RT-PCR (real time).^[2] Porén, son técnicas distintas. A PCR con reversotranscriptase (RT-PCR) utilízase para detectar cualitativamente a expresión xénica por medio da creación dun ADN complementario (ADNc) reversotranscrito a partir dun ARN, mentres que, ao contrario, a qPCR úsase para medir cuantitativamente a amplificación dun ADN usando sondas fluorescentes^[2][3] en tempo real.^[4]

Tamén hai que distinguir entre a RT-PCR e a PCR tradicional. Aínda que a PCR con transcriptase inversa (RT-PCR) e a PCR tradicional producen ambas moitas copias dun ADN particular illado por amplificación, as aplicacións das dúas técnicas son moi distintas. A PCR tradicional utilízase para amplificar exponencialmente secuencias de ADN dianas. A RT-PCR utilízase para clonar xenes expresados por reversotranscrición do ARN de interese a un ADN complementario por medio do uso do encima transcriptase inversa. Seguidamente, o que se fai é que ese ADNc sintetizado novamente é amplificado usando a PCR tradicional.

Tamén é posible combinar a RT-PCR coa qPCR. Ademais do estudo cualitativo da expresión xénica, tamén se pode, facendo uso neste caso da PCR cuantitativa (qPCR), cuantificar o ARN, tanto en termos absolutos coma relativos,^[5] técnica que se utilizaría conxuntamente coa RT-PCR. A técnica combinada (RT-PCR + qPCR) denomínase "RT-PCR cuantitativa" ou "RT-PCR en tempo real"^[6][7][8]), que a miúdo se abrevia como qRT-PCR,^[9] ou RT-qPCR,^[10] ou RRT-PCR.^[11] Comparado con outros métodos de cuantificación do ARN, como o northern blot, a qRT-PCR considérase que é a proba cuantitativa máis potente e sensible para a detección dos niveis do ARN. Utilízase frecuentemente na análise de expresión dun ou moitos xenes, e os patróns de expresión para a identificación de infeccións e doenzas.^[5]

Para evitar calquera tipo de confusión, na seguinte táboa figuran as abreviacións que se utilizarán neste artigo de agora en adiante e a técnica á que se refiren:

1. ↑ Freeman WM, Walker SJ, Vrana KE (January 1999). "Quantitative RT-PCR: pitfalls and potential". BioTechniques 26 (1): 112–22, 124–5. PMID 9894600. 
2. ↑ ^{2,0 2,1} Mackay, Ian (2007). Real-time PCR in Microbiology: From Diagnosis to Characterization. Norfolk, England: Caister Academic Press. pp. 440. ISBN 1-904455-18-2. 
3. ↑ Radonić A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A (January 2004). "Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR". Biochemical and Biophysical Research Communications 313 (4): 856–62. PMID 14706621. doi:10.1016/j.bbrc.2003.11.177. Consultado o 2012-11-06. 
4. ↑ Livak KJ, Schmittgen TD (December 2001). "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method". Methods 25 (4): 402–8. PMID 11846609. doi:10.1006/meth.2001.1262. Consultado o 2012-11-06. 
5. ↑ ^{5,0 5,1} "groups.molbiosci.northwestern.edu" (PDF). Consultado o 2012-11-06. 
6. ↑ Joyce C (2002). "Quantitative RT-PCR. A review of current methodologies". Methods Mol. Biol. 193: 83–92. PMID 12325527. doi:10.1385/1-59259-283-X:083. 
7. ↑ Kang XP, Jiang T, Li YQ; et al. (2010). "A duplex real-time RT-PCR assay for detecting H5N1 avian influenza virus and pandemic H1N1 influenza virus". Virol. J. 7: 113. PMC 2892456. PMID 20515509. doi:10.1186/1743-422X-7-113. Consultado o 2012-11-06. 
8. ↑ Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (June 2005). "Quantitative real-time RT-PCR--a perspective". J. Mol. Endocrinol. 34 (3): 597–601. PMID 15956331. doi:10.1677/jme.1.01755. Consultado o 2019-04-24. 
9. ↑ Varkonyi-Gasic E, Hellens RP (2010). "qRT-PCR of Small RNAs". Methods Mol. Biol. 631: 109–22. PMID 20204872. doi:10.1007/978-1-60761-646-7_10. Consultado o 2012-11-06. 
10. ↑ Taylor S, Wakem M, Dijkman G, Alsarraj M, Nguyen M (April 2010). "A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines". Methods 50 (4): S1–5. PMID 20215014. doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.005. Consultado o 2012-11-06. 
11. ↑ Spackman E, Senne DA, Myers TJ; et al. (September 2002). "Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes". J. Clin. Microbiol. 40 (9): 3256–60. PMC 130722. PMID 12202562. doi:10.1128/jcm.40.9.3256-3260.2002. Consultado o 2012-11-06.